Protocolli del congelamento di ovuli

Sono due i metodi di crioconservazione esistenti: il metodo lento (congelamento) e il metodo più innovativo e ultrarapido, conosciuto come vitrificazione. Le principali differenze tra questi due metodi si basano su fattori come la sopravvivenza degli ovociti, il tasso di fecondazione, lo sviluppo degli embrioni dopo essere stati fecondati, la formazione dell'apparato meiotico negli ovociti e il loro allineamento cromosomico.

I protocolli che si seguirono per effettuare il congelamento e il decongelamento lento modificato degli ovociti, o la vitrificazione e devitrificazione degli ovociti vengono riferiti di seguito:

Congelamento - Decongelamento ovocitario lento modificato

Congelamento lento modificato

Questo procedimento si basa sul metodo di congelamento di Fabbri e collaboratori, per il quale, dopo aver denudato gli ovociti vennero introdotti in un mezzo di coltura basato su un fluido tubarico umano (HTF) che conteneva un concentrazione di 1.5 M e di 1,2 propanodiolo (PROH).

Da qui si trasferirono per 10 minuti nel mezzo di congelamento da 0,5 M PROH y 0.3 M di saccarosio.

Gli ovociti si divisero in gruppi di due o tre e vennero inseriti in provette con chiusura termica e vennero collocati in un congelatore programmabile a 25ºC, dove si raffredderanno poco a poco seguendo i passi successivi:

• Raffreddamento, in cui la temperatura si abbassa di 2ºC al minuto.
• Quando arriva a 7ºC sotto zero si effettua il "seeding" manuale e si mantengono a -7ºC per 10 minuti.
• Si presegue con il raffreddamento, diminuendo la temperatura di 0,3ºC al minuto fino ad arrivare a -33ºC.
• Si immergono nell'azoto liquido a -196ºC.

Descongelamento lento modificato

Vennero esratte le provette e si proseguì con il seguente protocollo:

• Si lasciarono 40 secondi a temperatura ambiente.
• Si sommersero a bagno maria per 60 secondi a una temperatura di 31ºC.
• Vennero lavati-idratati in maniera sequenziale, per eliminare i resti del crioprotettore.
• Si mantenerro in in mezzo HTF nell'incubatore a 37ºC per due o tre ore prima di microinniettarli (ICSI).

Per procedere alla vitrificazione degli ovociti, si effettuarono i seguenti passi:

• Si immersero in un ambiente di equilibrio, composto da etilenglicole (EG) e PROH (al 7,5% v/v), per 5 minuti.
• Si trasferirono in un ambiente di vitrificazione tra i 40 e i 60 secondi, composto da EG e PROH (al 15% v/v) e 0,5 M di sacccarosio.

Devitrificazione

Si utilizzò la stessa casa commerciale e si fece quanto segue:

• Si introdusse la provetta a 37ºC in 1 M di saccarosio per 3 minuti, passando per tre diverse concentrazioni della stessa, in maniera decrescente, per un minuto ciascuno (1 M, 0’50 M e 0’25 M).
• Gli ovociti passarono a un ambiente di lavaggio, due volte di seguito.
• Dopo 2-3 ore di coltivazione, si esaminò l'integrità della membrana e gli ovociti intatti si microinniettarono (ICSI).